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产品概述
product description
贝博® BBcellProbe® M12线粒体染色试剂盒是利用BBcellProbe® M系列探针进行线粒体特异性染色的试剂盒。本试剂盒中的BBcellProbe® M12线粒体染色探针为深红色荧光标记的线粒体探针，具有645/666 nm的最大激发/发射波长。本品适合双标实验，因其深红色荧光与其他的绿色荧光探针具有良好的分辨率。
BBcellProbe® M系列探针是一种细胞渗透型的对活细胞中的线粒体体进行选择性染色的一类新型荧光染料，该系列探针可以选择性标记线粒体，包含标记线粒体的弱巯基反应性的氯甲基官能团。只需简单孵育细胞，即可穿过细胞膜并直接聚集在活性线粒体上。可有效标记活细胞。一旦线粒体被染色后，还能根据后续实验的需求进行固定（醛类固定剂如甲醛）和透化（醛类去污剂如Triton X-100），探针依然维持在细胞内。
虽然传统的线粒体荧光探针如TMR和罗丹明123，也能很容易的聚集在功能线粒体上，但是一旦线粒体膜电位丧失即会被洗掉，从而在一些需要细胞进行醛类固定或者包含线粒体能量状态影响因子的实验中，使其应用大受限制，而BBcellProbe® M系列探针不受线粒体膜电位影响。
保存温度
-20℃保存
注意事项
1. M12染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
2. 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
3. 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
4. 标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
5. 染色后立即进行分析。
6. 必须使用细胞荧光检测专用的黑色细胞培养板。
2. 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
3. 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
4. 标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
5. 染色后立即进行分析。
6. 必须使用细胞荧光检测专用的黑色细胞培养板。
有效期
6个月
检测方法
1. 激光共聚焦
2. 荧光显微镜
2. 荧光显微镜
适用样本
1. 悬浮细胞
2. 贴壁细胞
2. 贴壁细胞
产品应用
1. 激光共聚焦
2. 荧光显微镜
3. 流式细胞仪
2. 荧光显微镜
3. 流式细胞仪
仪器准备
1. 激光共聚焦/荧光显微镜
2. 离心机
3. 移液器
4. 冰箱
5. 冰盒
2. 离心机
3. 移液器
4. 冰箱
5. 冰盒
试剂准备
1. PBS缓冲液 或者HBSS
耗材准备
1. 离心管
2. 吸头
3. 一次性手套
2. 吸头
3. 一次性手套
使用注意事项
1. M12染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
2. 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
3. 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
4. 标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
5. 染色后立即进行分析。
6. 必须使用细胞荧光检测专用的黑色细胞培养板。
2. 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
3. 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
4. 标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
5. 染色后立即进行分析。
6. 必须使用细胞荧光检测专用的黑色细胞培养板。
使用方法
1. 染色工作液配制：
根据样本数量，用染料稀释液将BBcellProbe® M12荧光染料10倍稀释，再用相应的培养基或者HBSS缓冲液100-2000倍稀释（对于后续需要做固定或透化的样本，100-500倍稀释），配制成染色工作液。
2. 细胞染色
2.1 对于贴壁细胞
1）培养皿/培养板准备细胞样本。
2）待细胞生长到合适丰度，吸除培养液，加入适量37℃预热的含探针工作液。于生长状态下孵育15分钟～45分钟（具体孵育时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。
3）利用新鲜培养基替换上述染色液。
4）荧光显微镜（含合适滤片）或流式细胞仪、荧光酶标仪下观察。最大激发/发射波长为644 / 666 nm。或者进行后续的固定和透化步骤。
2.2 对于悬浮细胞
1）离心，吸除上清。
2）利用37℃预热的探针工作液重悬细胞，于生长状态下孵育15分钟～45分钟（具体时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。
3）离心，吸除染色液，加入新鲜培养液重悬细胞。
4）置于荧光镜下观察。或流式细胞仪、荧光酶标仪检测。最大激发/发射波长为644 / 666 nm。或者进行后续的固定和透化步骤。
3. 固定和透化：
1）染色结束后，利用培养液或缓冲液清洗细胞；
2）小心吸走清洗液。换用新鲜配制且预热的含2-4%甲醛的缓冲液或培养液进行细胞固定。
3）清洗细胞：吸除固定液，用适当缓冲液冲洗细胞数次。
4）细胞透化（可选）：
ICC等实验需要细胞要做透化，可将已固定的细胞直接加入含有去污剂如Triton X-100的缓冲液中孵育。透化结束后，用缓冲液清洗细胞即可进行后续ICC实验。一般用含0.2% Triton X-100的PBS孵育细胞10分钟可以达到良好的透化效果。还可利用预冷的丙酮透化5 分钟，之后用PBS清洗细胞。经验证，即使后继没有进一步的抗体标记，丙酮透化处理也可降低背景信号。
根据样本数量，用染料稀释液将BBcellProbe® M12荧光染料10倍稀释，再用相应的培养基或者HBSS缓冲液100-2000倍稀释（对于后续需要做固定或透化的样本，100-500倍稀释），配制成染色工作液。
2. 细胞染色
2.1 对于贴壁细胞
1）培养皿/培养板准备细胞样本。
2）待细胞生长到合适丰度，吸除培养液，加入适量37℃预热的含探针工作液。于生长状态下孵育15分钟～45分钟（具体孵育时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。
3）利用新鲜培养基替换上述染色液。
4）荧光显微镜（含合适滤片）或流式细胞仪、荧光酶标仪下观察。最大激发/发射波长为644 / 666 nm。或者进行后续的固定和透化步骤。
2.2 对于悬浮细胞
1）离心，吸除上清。
2）利用37℃预热的探针工作液重悬细胞，于生长状态下孵育15分钟～45分钟（具体时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。
3）离心，吸除染色液，加入新鲜培养液重悬细胞。
4）置于荧光镜下观察。或流式细胞仪、荧光酶标仪检测。最大激发/发射波长为644 / 666 nm。或者进行后续的固定和透化步骤。
3. 固定和透化：
1）染色结束后，利用培养液或缓冲液清洗细胞；
2）小心吸走清洗液。换用新鲜配制且预热的含2-4%甲醛的缓冲液或培养液进行细胞固定。
3）清洗细胞：吸除固定液，用适当缓冲液冲洗细胞数次。
4）细胞透化（可选）：
ICC等实验需要细胞要做透化，可将已固定的细胞直接加入含有去污剂如Triton X-100的缓冲液中孵育。透化结束后，用缓冲液清洗细胞即可进行后续ICC实验。一般用含0.2% Triton X-100的PBS孵育细胞10分钟可以达到良好的透化效果。还可利用预冷的丙酮透化5 分钟，之后用PBS清洗细胞。经验证，即使后继没有进一步的抗体标记，丙酮透化处理也可降低背景信号。
参考文献
1. Xican Li et al.
Inhibitory Effect and Mechanism of Action of Quercetin and Quercetin Diels-Alder anti-Dimer on Erastin-Induced Ferroptosis in Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells
Antioxidants 2020
2. Zhao Lv et al.
The modulation of Smac/DIABLO on mitochondrial apoptosis induced by LPS in Crassostrea gigas
Fish & Shellfish Immunology 2019
Inhibitory Effect and Mechanism of Action of Quercetin and Quercetin Diels-Alder anti-Dimer on Erastin-Induced Ferroptosis in Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells
Antioxidants 2020
2. Zhao Lv et al.
The modulation of Smac/DIABLO on mitochondrial apoptosis induced by LPS in Crassostrea gigas
Fish & Shellfish Immunology 2019
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