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产品概述
product description
贝博® BBcellProbe® 活细菌/死细菌染色试剂盒（DMAO/PI）是采用BBcellProbe® DMAO/PI绿色-红色荧光探针双染细菌的方法染色活细菌和死细菌。
细菌细胞活性取决于其代谢特征或膜完整性。但是依赖于代谢特征的检测方法通常只适用于部分细胞类型。评估细胞膜完整性的方法具有更高的灵敏度和更普遍的适用性。
贝博® BBcellProbe® 活细菌/死细菌染色试剂盒利用细菌细胞膜的完整性差异，可以可靠地进行染色并在几分钟内定量区分活细菌和死细菌。
本试剂盒中的BBcellProbe® DMAO绿色荧光的细菌核酸探针，能透过活细菌的完整结构的质膜，既能染色活细菌，也能染色死细菌。DMAO对革兰氏阳性和阴性细菌均适用，具有500 / 526 nm的最大激发/发射波长。
保存温度
2-8℃ 避光保存
注意事项
1.染料长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。2. 染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。3.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。4. 试剂拆封后请尽快使用完！
有效期
一年
检测方法
荧光酶标仪/荧光光度计/激光共聚焦/流式细胞仪/荧光显微镜等
适用样本
细菌
产品应用
荧光酶标仪/荧光光度计/激光共聚焦/流式细胞仪
仪器准备
1. 荧光酶标仪/荧光光度计/激光共聚焦/流式细胞仪/荧光显微镜等
2. 离心机
3. 移液器
4. 冰箱
5. 冰盒
2. 离心机
3. 移液器
4. 冰箱
5. 冰盒
试剂准备
0.85% NaCl溶液
耗材准备
1. 离心管
2. 吸头
3. 一次性手套
4. 黑色透明底96孔细胞培养板
2. 吸头
3. 一次性手套
4. 黑色透明底96孔细胞培养板
使用注意事项
1. 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2. 染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
3. 试剂A为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。
4. 建议收到产品后，根据单次使用量，对DMAO母液进行小量分装，每次使用一管，试剂-20℃避光冻存，一年稳定。
5. 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
6. 所有染色操作在塑料容器进行，不要在玻璃容器染色。
7. 以下为进行活死细菌染色观察的参考步骤，可以根据文献的方法进行调整。如果有必要，也可以设定对照活细菌和死细菌，进行定量检测。可以参考附录中的对照细胞设定方法，也可以根据需要自己设定对照和检测方法。
8. 标记的条件因细菌种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细菌类型、细菌的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
9. 流式检测时建议添加直径6.0 µm微球标准品。
10. 细菌类型会明显影响红色荧光的量。
2. 染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
3. 试剂A为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。
4. 建议收到产品后，根据单次使用量，对DMAO母液进行小量分装，每次使用一管，试剂-20℃避光冻存，一年稳定。
5. 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
6. 所有染色操作在塑料容器进行，不要在玻璃容器染色。
7. 以下为进行活死细菌染色观察的参考步骤，可以根据文献的方法进行调整。如果有必要，也可以设定对照活细菌和死细菌，进行定量检测。可以参考附录中的对照细胞设定方法，也可以根据需要自己设定对照和检测方法。
8. 标记的条件因细菌种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细菌类型、细菌的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
9. 流式检测时建议添加直径6.0 µm微球标准品。
10. 细菌类型会明显影响红色荧光的量。
使用方法
染色工作液的配制：
根据样品数按下列比例配制染色工作液。
用37℃培养箱预热0.85% NaCl溶液将BBcellProbe® DMAO荧光染料进行500倍稀释，将PI进行100-500倍稀释，配制成染色工作液。
例如：
每10 ml 0.85% NaCl溶液中加入20 μl染色液A，充分混匀，即成染色工作液A。
每10 ml 0.85% NaCl溶液中加入20-100 μl染色液B，充分混匀，即成染色工作液B。
细菌染色：
1. 收集样本细菌，用0.85% NaCl溶液洗涤细胞3次。
2. 用100 μl-200 μl染色工作液将细菌重悬。
3. 在室温避光孵育15分钟。
4. 用0.85% NaCl溶液洗涤细菌一次。
5. 用适量0.85% NaCl溶液重悬细菌。
6. 将5 μl菌液滴加到载玻片，盖上盖玻片，油镜观察。
7. 用荧光显微镜观察。激发波长为488 nm，最大发射波长为520 nm和635 nm。
结果分析 ：
可以在Ex / Em = 488 / 520 nm（FITC滤光器组）和540 / 635 nm（TRITC滤光器组）下荧光测量染色细胞，分别用于活细菌和死细菌。
荧光显微镜下，使用490±10 nm波长激发，活细菌为黄绿色，死细菌为红色。
用545 nm波长激发，仅能够看到红色的死细菌。
根据样品数按下列比例配制染色工作液。
用37℃培养箱预热0.85% NaCl溶液将BBcellProbe® DMAO荧光染料进行500倍稀释，将PI进行100-500倍稀释，配制成染色工作液。
例如：
每10 ml 0.85% NaCl溶液中加入20 μl染色液A，充分混匀，即成染色工作液A。
每10 ml 0.85% NaCl溶液中加入20-100 μl染色液B，充分混匀，即成染色工作液B。
细菌染色：
1. 收集样本细菌，用0.85% NaCl溶液洗涤细胞3次。
2. 用100 μl-200 μl染色工作液将细菌重悬。
3. 在室温避光孵育15分钟。
4. 用0.85% NaCl溶液洗涤细菌一次。
5. 用适量0.85% NaCl溶液重悬细菌。
6. 将5 μl菌液滴加到载玻片，盖上盖玻片，油镜观察。
7. 用荧光显微镜观察。激发波长为488 nm，最大发射波长为520 nm和635 nm。
结果分析 ：
可以在Ex / Em = 488 / 520 nm（FITC滤光器组）和540 / 635 nm（TRITC滤光器组）下荧光测量染色细胞，分别用于活细菌和死细菌。
荧光显微镜下，使用490±10 nm波长激发，活细菌为黄绿色，死细菌为红色。
用545 nm波长激发，仅能够看到红色的死细菌。
参考文献
1. Zhenda Liang et al.
Oxygen-defective MnO2/ZIF-8 nanorods with enhanced antibacterial activity under solar light
Chemical Engineering Journal 2021 （IF = 13.273）
2. Duo Xu et al.
Ti-6Al-4V-5Cu synthesized for antibacterial effect in vitro and in vivo via contact sterilization
Journal of Materials Science & Technology 2021 （IF = 11.200）
3. Liang Ren et al.
Construction of high selectivity and antifouling nanofiltration membrane via incorporating macrocyclic molecules into active layer
Journal of Membrane Science 2020 （IF = 10.530）
4. Ping Li et al.
Metal-organic frameworks with photocatalytic bactericidal activity for integrated air cleaning
Nature Communications 2019 （IF = 14.919）
Oxygen-defective MnO2/ZIF-8 nanorods with enhanced antibacterial activity under solar light
Chemical Engineering Journal 2021 （IF = 13.273）
2. Duo Xu et al.
Ti-6Al-4V-5Cu synthesized for antibacterial effect in vitro and in vivo via contact sterilization
Journal of Materials Science & Technology 2021 （IF = 11.200）
3. Liang Ren et al.
Construction of high selectivity and antifouling nanofiltration membrane via incorporating macrocyclic molecules into active layer
Journal of Membrane Science 2020 （IF = 10.530）
4. Ping Li et al.
Metal-organic frameworks with photocatalytic bactericidal activity for integrated air cleaning
Nature Communications 2019 （IF = 14.919）
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