2-8℃

1. PKH26荧光探针在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
2. 荧光染色剂为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3. 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
4. 试剂拆封后请尽快使用完！

一年

外泌体

1. 流式细胞仪/荧光显微镜/激光共聚焦
2. 离心机
3. 移液器
4. 冰箱
冰盒

1. PBS缓冲液或者HBSS

1. 离心管
2. 吸头
3. 一次性手套

1. 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
2. 配制的PKH26母液极易水解，建议分装保存，分装后用封口膜密封管口，再用锡箔纸包裹，最好和干燥剂一起用塑料袋密封，≦-20℃冷冻保存。
3. PKH26工作液应现配现用，不能提前配制，因为PKH26吸水会分解，影响染色效果。
4. PKH26易被水解，在水溶液中会很快变质。母液请在使用过程中避免接触水。工作液在标记细胞的过程中和水接触是在许可的时间范围内的。
5. PKH26溶解液在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以37℃水浴片刻至全部融解后使用。
6. 不同的外泌体种类标记后可以示踪的时间差异较大，请根据实际情况或参考文献进行检测。

试剂配制：
从冰箱中取出PKH26试剂，静置几分钟至室温，或者37℃水浴片刻后，离心盛放PKH26的管子，开盖前请务必离心几分钟让试剂充分落入管底后才能开盖。

外泌体染色：
1. 根据需要检测的样品数，用稀释液将探针10倍稀释，再用合适的溶液（如：无血清培养基，HBSS或PBS）20倍稀释，配制成染色工作液。
2. 将制备好的待染色外泌体样本用100 μl染色工作液重悬。
3. 在室温或37℃避光孵育5-30分钟。
染色样品预处理：
1. 将样品在4℃条件下，3000×g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。
2. 小心将上清移入另一干净离心管中。
3. 将样品在4℃条件下，10000×g离心20分钟。弃沉淀，收集上清。
4. 小心将上清移入另一干净离心管中。
5. 进行下列外泌体纯化步骤操作。
清洗外泌体纯化离心管：
1. 用缓冲液或纯水进行预清洗。
2. 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。
外泌体纯化：
1. 将外泌体纯化离心管内管插入所提供的一个微量离心管中。
2. 向内管中加入过100 ul的待纯化外泌体样本，并盖上盖子。
3. 将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，让盖子的连接带朝着转子的中央；用一个类似的离心管平衡。
4. 以5000-8000 ×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余20ul-30ul液体。
5. 加入70ul PBS缓冲液。
6. 以5000-8000 ×g离心约1-15分钟。离心至大约剩余20ul-50ul液体。
7. 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。
8. 为了回收纯化后的外泌体，将内管倒过来插在另一个干净的微量离心管中。放在离心机中，让打开的盖子朝着转子的中央；用一个类似的离心管进行平衡。
9. 以1000 x g离心2分钟，使纯化后的外泌体样本从纯化内管转移到收集管中。
10. 吸取收集管中的液体，即得到外泌体样品纯品。
11. 用纯水或缓冲液洗涤内管和收集管，继续纯化下一个样品。
外泌体纯化离心管清洗和保存：
1. 使用后用水冲洗干净；
2. 内管加入超纯水500µl，5000g离心5分钟；
3. 吸净内管中的水，加入500µl 0.1M NaOH，5000g离心20分钟；
4. 用0.1M NaOH 浸泡24小时；
5. 用水冲洗干净；
6. 用无菌水浸泡2-8℃保存。
7. 外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。

1. 外泌体纯化管内管膜会因为离心时间过长而变干么？
不会，因为内管有死体积，总会有溶液残留在内管中。死体积大约10-20ul。

2. 可以重复使用过滤管么？
可以重复使用。如果使用、清洗、保存得当，可以反复使用多次。但是超过8次重复使用后过滤膜有破损风险，注意使用过程中尽量避免尖锐物品戳到膜。离心力不要过大。

3. 外泌体在纯化时出现了沉淀，如何改进？
如果过滤过快或者过度浓缩都有可能引起沉淀。如果样品的外泌体浓度很高，建议降低最终的外泌体浓度，保留更多的液体。
对于因过滤速度敏感而导致的沉淀，建议的改进方法是：
1）离心力降低30%-50%
2）在过滤过程中取出过滤管，用枪头反复吹吸几次。

4. 有时候用外泌体纯化离心管连水都离不下来，可能是什么原因？
如果出现这种情况，可能时过滤膜的孔被堵住。请先用0.1M NaOH清洗再离心。最后用缓冲液或纯水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用，如暂时不用，请保持润湿状态，避免重新干燥。

5. 说明书中推荐在室温下进行离心，考虑到外泌体的稳定性，是否可以在4℃进行离心？
可以，但是低温可能会增加外泌体样品的粘性，导致流速减慢，建议可将离心时间延长。

1. Zhenwei Lian et al.
Exosomes derived from normal human bronchial epithelial cells down-regulate proliferation and migration of hydroquinone-transformed malignant recipient cells via up-regulating PTEN expression
Chemosphere 2019

2. Ran Jiang et al.
Exosomal miR‐221 derived from hydroquinone‐transformed malignant human bronchial epithelial cells is involved in cell viability of recipient cells
Journal of Applied Toxicology 2019