2-8℃

1. 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。
2. 试剂拆封后请尽快使用完！

一年

液体样本

1. 使用方便，无需超速离心，省时省力；
2. 纯度高，富集量大，应用范围广；
3. 获取的Exosome结构和功能完整；
4. 稳定性好，便于运输，便于保存。

1. 离心机（可以离心15ml圆锥形离心管）
2. 移液器（200ul）
3. 冰箱
冰盒

1. PBS缓冲液 或者HBSS2. 纯水

1. 离心管
2. 吸头
3. 一次性手套

1. 以下以以下以4 ml细胞培养上清和2 ml血清/血浆/体液为例，实际操作时按样本和提取液用量体积比等比例调整使用即可。
2. 不同样本外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择样本的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的样本。
3. 一般巨噬细胞、淋巴细胞、造血细胞、胰腺癌细胞等分泌外泌体较多，其它细胞样本建议每个样培养基上清用量不少于8 ml。常规的细胞样本最佳培养上清上样量为15-20 ml及以上，条件允许的情况下采用尽可能多的细胞培养上清。
4. 常规的血清/血浆样本最佳上样量为3-5 ml及以上，条件允许的情况下采用尽可能多的血清/血浆样本。
5. 条件允许的情况下可以将细胞培养上清浓缩后再提取外泌体。
6. 在收获细胞时，应确定死亡细胞不超过5%。细胞凋亡/死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡，它们在外泌体的提取过程中会污染活细胞产生的外泌体。
7. 已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。

清洗外泌体纯化离心管D：
1. 用缓冲液或纯水进行预清洗。
2. 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。

细胞培养上清外泌体提取：
1. 收集4 ml待提取的培养上清样品，置2-8℃保存。
【注】：
 冻存样品置水浴锅解冻后置2-8℃保存。
2. 将样品在4℃条件下，3000×g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。
3. 小心将上清移入另一干净离心管中。
4. 将样品在4℃条件下，10000×g离心20分钟。弃沉淀，收集上清。
5. 小心将上清移入另一干净离心管中。即为4 ml待提取细胞培养上清（I）。然后进行下列外泌体纯化步骤操作。

细胞培养上清外泌体纯化：
1. 将外泌体纯化离心管D内管插入所提供的一个配套离心管中。
2. 向内管中加入过4 ml的待提取细胞培养上清（I）样本，并盖上盖子。
3. 将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，用一个类似的离心管平衡。
4. 以4000×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。
5. 在50-100 μl残余液体中加入2 ml外泌体提取液A。
6. 以4000×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。
7. 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。
8. 为了回收纯化后的外泌体，用200 μl移液器插入纯化管的底部，吸出纯化后的50 μl - 100 μl
9. 用纯水或缓冲液洗涤内管和收集管，继续纯化下一个样品。

体液外泌体提取：
8. 血清、血浆、尿液、脑脊液、腹水、羊水、乳汁、唾液等液体类样本按以下步骤提取。以下步骤中以血清为例，尿液、脑脊液、腹水、羊水、乳汁、唾液等样本与血清步骤相同。

1. 收集2 ml待提取的血清样品，置2-8℃保存。
2. 将样品在4℃条件下，3000×g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。
3. 小心将上清移入另一干净离心管中。
4. 将样品在4℃条件下，10000×g离心20分钟。弃沉淀，收集上清。
5. 小心将上清移入另一干净离心管中。
6. 在2 ml血清样品中加入2 ml提取液B，盖紧离心管盖。
7. 轻轻上下颠倒混匀1分钟左右，使液体充分混匀。制备成4 ml待提取外泌体悬液（I）。然后进行下列外泌体纯化步骤操作。

体液外泌体纯化：
1. 将外泌体纯化离心管D内管插入所提供的一个配套离心管中。
2. 向内管中加入过4 ml的待提取外泌体悬液样本，并盖上盖子。
3. 将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，用一个类似的离心管平衡。
4. 以4000×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。
5. 以4000×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50 μl-100 μl液体。
6. 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。
7. 为了回收纯化后的外泌体，用200 μl移液器插入纯化管的底部，吸出纯化后的50 μl -100 μl纯化外泌体，即得到外泌体样品。
8. 用纯水或缓冲液洗涤内管和收集管，继续纯化下一个样品。

外泌体纯化离心管清洗和保存：
1. 使用后用水冲洗干净；
2. 内管加入超纯水4 ml，4000×g离心5分钟；
3. 吸净内管中的水，加入4 ml 0.1 M NaOH，4000×g离心20分钟；
4. 用0.1 M NaOH 浸泡24小时；
5. 用水冲洗干净；
6. 用无菌水浸泡2-8℃保存。

1. 培养细胞时，如何去除血清来源的外泌体？
多数情况下，细胞在体外培时养需要血清，而血清中一般都含有外泌体，为避免血清对细胞外泌体的污染，可采用以下3种方法：（1）选择商品化的无外泌体血清进行细胞培养；（2）选择无血清培养基进行细胞培养；（3）将细胞培养用的血清通过100000×g 超速离心10小时以上以去除血清外泌体。

2. 无外泌体血清培养基（或者无血清培养基）在什么时候使用？
细胞在正常含血清的培养基中培养一定的时间后，细胞融合度约为60%-70%时，移去原有含血清的培养基，换成新鲜的无外泌体血清培养基（或者无血清培养基），继续培养24-48 h，细胞融合度达到80%-95%左右时收取上清,该上清液即可用于提取外泌体。

3. 准备做细胞外泌体siRNA 的NGS 测序，初始样品量需要准备多少？
普通肿瘤细胞系建议使用40 mL 以上的初始样品量。由于某些细胞（如悬浮细胞、干细胞、神经细胞等）中外泌体含量比较低，建议先将上清浓缩，准备40mL 以上的浓缩液再使用本试剂盒提取外泌体。

4. 采用血浆（plasma）还是血清(serum)来源的外泌体？
对于大多数涉及到Exosome RNA分离的研究，我们推荐使用血浆（plasma）。因为血清收集后在凝血过程中，血小板受到刺激会产生许多Exosome和其他形式的小泡，因此血清中获得的小泡始终比血浆中多，甚至超过50%的小泡来源于血小板。所以血浆是研究病理生理状态下Exosome更好的介质。多数的criculating Exosome研究样本使用的是血浆。负压采血之后，血液首先存放入采血管，去除止血带，最初的几毫升不要，因为有压力激活效应，并且被成纤维细胞污染。血液收集应该轻柔并且迅速。颠倒混匀采血管8-10次，与管壁上的抗凝剂混合，但不要为了抗凝而剧烈摇动。离心前管子应该垂直存放，并记录实验室中存放的时间，因为从采血到离心除去细胞和血小板这中间的过程很重要，建议在30 min内完成，长时间的存放，而没有及时处理会导致血小板细胞Exosome的进一步释放。血液要尽快处理，在室温条件下分离血浆（或者血清）。所有样品要使用相同的转速和转子类型离心。

5. 怎样选择抗凝剂？
抗凝剂有一个或多个形式的功能,包括螯合钙、蛋白酶抑制和抑制血小板活化。一般选用EDTA抗凝。其它有许多抗凝血剂可用，但不建议使用肝素（heparin）抗凝剂。无论是外源性或内源性起源（例如肥大细胞），肝素会抑制下游PCR反应，因为肝素会与引物和酶竞争与核酸结合。另外,肝素可抑制Exosome与靶细胞的结合,抑制Exosome激活血小板或降低血小板激活阈值。应用肝素治疗的病人也应该注意。 对于珍贵样本，可能需要从肝素化的血液样品中提取RNA。核酸的检测需要通过调整PCR的敏感性。另外如果Exosome相关核酸被发现只存在于Exosome内,在RNA分离之前的洗涤也可以帮助去除肝素。其它抗凝剂如EDTA、氟化钠/草酸钾(NaF/KOx),或柠檬酸三钠[加入/不加右旋糖dextrose(ACD)或茶碱(theophylline)、腺苷(adenosine)和双嘧达莫(CTAD)]就更复杂了，最好根据下游的试验来指导。CTAD阻碍血小板活化和随后的Exosome释放。EDTA可干扰PCR反应(尽管程度低于肝素),但它的存在可能是无害的。另外,下游实验的选择需要考虑到抗凝剂的使用种类。不同的聚合酶对抑制剂有不同的敏感性。

6. 采血管的选择方法？
血浆采用紫盖采血管（EDTA-K2 或 EDTA-K3），例如BD货号：367841-2 ml 367862-4 ml 367863-6 ml 366643-10 ml 等；血清采用黄盖采血管（促凝管或促凝管带分离胶），例如BD货号：366566-5 ml 367985-10 ml 等。

7. 如何鉴定提取的外泌体？
通常使用透射电镜检测（形态）、粒径检测（大小）、外泌体标志蛋白Western blot检测等方法鉴定提取的外泌体。

8. 外泌体WB标志蛋白用什么？
在进行WB检测时，通常检测外泌体标志蛋白为CD63、CD9、CD81、TSG101 、ALIX、HSP70等。

9. 进行外泌体WB鉴定时有什么内参蛋白可供选择？
没有，该检测属于定性检测。

10. 蛋白浓度低？
很多细胞外泌体量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大培养上清的上样量。
处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。请选择高质量的蛋白裂解液或蛋白提取试剂盒。

11. 抽提得到的RNA浓度低？
很多细胞外泌体量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大培养上清的上样量。

12. 外泌体纯化管内管膜会因为离心时间过长而变干么？
不会，因为内管有死体积，总会有溶液残留在内管中。死体积大约10-20μl。

13. 可以重复使用过滤管么？
可以重复使用。如果使用、清洗、保存得当，可以反复使用多次。但是超过8次重复使用后过滤膜有破损风险，注意使用过程中尽量避免尖锐物品戳到膜。离心力不要过大。

14. 外泌体在纯化时出现了沉淀，如何改进？
如果过滤过快或者过度浓缩都有可能引起沉淀。如果样品的外泌体浓度很高，建议降低最终的外泌体浓度，保留更多的液体。
对于因过滤速度敏感而导致的沉淀，建议的改进方法是：
1）离心力降低30%-50%
2）在过滤过程中取出过滤管，用枪头反复吹吸几次。

15. 有时候用外泌体纯化离心管连水都离不下来，可能是什么原因？
如果出现这种情况，可能时过滤膜的孔被堵住。请先用0.1 M NaOH清洗再离心。最后用缓冲液或纯水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用，如暂时不用，请保持润湿状态，避免重新干燥。

16. 说明书中推荐在室温下进行离心，考虑到外泌体的稳定性，是否可以在4℃进行离心？
可以，但是低温可能会增加外泌体样品的粘性，导致流速减慢，建议可将离心时间延长。

1. Yue Zhang et al.
Cancer-associated fibroblasts-derived exosomal miR-17-5p promotes colorectal cancer aggressive phenotype by initiating a RUNX3/MYC/TGF-β1 positive feedback loop
Cancer Letters 2020

2. Ruiyu Liu et al.
iTRAQ-based proteomics and in vitro experiments reveals essential roles of ACE and AP-N in the renin–angiotensin system-mediated congenital ureteropelvic junction obstruction
Experimental Cell Research 2020

3. Feng Tian et al.
miR-210 in Exosomes Derived from Macrophages under High Glucose Promotes Mouse Diabetic Obesity Pathogenesis by Suppressing NDUFA4 Expression
Journal of Diabetes Research 2020