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  • 组织单细胞悬液制备方法
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    流式细胞术对细胞的各种参数分析必须基于单细胞的基础上,根据不同实体组织成分的特点可选择不同的分散细胞的方法,以期达到单细胞产量高、细胞损伤小的目的。在实体组织分散为单细胞的过程中,解离的方法有可能瞬间或持久地影响细胞的性质,比如,形态上显而易见的细胞膜破损,细胞表面上可出现泡状特征,还有一些是难以观察到的线粒体活性的变化、选择性膜表面抗原的丢失、蛋白质的丢失等,细胞受损程度受温度、pH值、处理时间等多种因素的影响。机械性或人工制备的单细胞,在某些性质上很可能已改变了原组织细胞特性,因此处理不同组织时,努力摸索方法,尽可能采用对细胞损伤小,产率较高的单细胞悬液制备方法,最大限度地保持细胞原有特性。下面介绍几种细胞悬液制备方法,仅供参考。
    一、酶消化法
    酶的作用原理主要有三方面:一是破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等,二是水解组织细胞的紧密连接结构的蛋白质,三是水解组织粘多糖物质。酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类有:胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶、弹性蛋白酶等。可根据分散的组织类型确定使用的酶类。需要注意的是使用条件和影响因素(酶浓度、酶效价、作用时间、pH值)等,如胃蛋白酶在碱性环境下失去活性,胰酶在中性溶液中活性欠佳。
    酶消化法常规程序如下:
    1、将适合于酶消化的组织置于离心管中。
    2、将选好的酶溶液1~2ml加入盛有被消化组织的试管中。
    3、常规消化20~30min(恒温37℃或室温),消化期间间断振荡或吹打。
    4、终止消化,收集细胞悬液,以300目尼龙网过滤,除去细胞,以低速离心除去细胞碎片。
    5、加入PBS 2ml充分混匀,离心弃掉上清。再加入0.5ml PBS重悬细胞。
    6、将制备好的单细胞悬液进行荧光标记后上机检测或保存备用。
    二、机械法
    机械法分散实体组织包括:用剪刀剪碎组织或用锋利的解剖刀剁碎组织,用匀浆器匀浆,用线注射针头反复抽吸细胞等,最后用300目尼龙网过滤细胞得到单细胞悬液。
    1、剪碎法
    (1)将组织块放入平皿中,加入少量生理盐水。
    (2)用剪刀将组织剪至匀浆状。
    (3)加入10ml生理盐水。
    (4)用吸管吸取组织匀浆,先以100目尼龙网过滤到试管内。
    (5)离心沉淀1000rpm/min,4~5min,再用生理盐水洗3次,每次以短时低速(500~800rpm/min)离心沉淀去除细胞碎片。
    (6)以300目尼龙网过滤去除细胞。
    (7)选择适当的固定液(70%冰乙醇等)固定细胞或低温保存备用。
    2、网搓法
    (1)将100目、300目尼龙网扎在小烧杯上。
    (2)把剪碎的组织放在网上,用眼科镊子轻轻搓组织块,边搓边用生理盐水冲洗,直到将组织搓完。
    (3)收集细胞悬液,离心沉淀细胞500~800rpm/min,2分钟。
    (4)固定细胞或低温保存备用。
    3、研磨法
    (1)先将组织剪碎成1~2mm3小块。
    (2)放入组织研磨器中加入1~2ml生理盐水。
    (3)转动研棒,研至匀浆。
    (4)加入10ml生理盐水,冲洗研磨器。
    (5)收集细胞悬液,并经300目尼龙网过滤,离心沉淀细胞,500~800rpm/min,2分钟,再用生理盐水洗3遍,离心沉淀。
    (6)固定或低温保存细胞,备用。
    三、化学处理法
    化学处理法的主要原理是:将组织细胞间起粘连作用的钙、镁离子置换出来,从而使细胞分散下来。
    1、试剂配制
    (1)0.2%EDTA配制:将0.2gEDTA溶解于100ml Hank液中,封装高压消毒,置0~4℃保存。
    (2)胰酶加EDTA配制:胰酶0.25g加PBS(pH7.0)200ml,浓度为0.125%,EDTA0.2g加PBS(pH7.0)100ml,浓度为0.2%。各取40ml混合,分装后置0~4℃冰箱保存,使用前过滤即可使用。
    2、实验方法
    (1)将组织切成薄片,置于试管。
    (2)首先加入EDTA液5ml,室温下0.5小时,离心弃之。
    (3)加入胰酶-EDTA液5~10ml,置37℃恒温水浴30min,间断振荡3~5次。
    (4)用300目尼龙网过滤,离心沉淀1000rpm/min,5分钟。再以生理盐水洗2~3次,离心500~800rpm,1~2分钟。
    (5)将细胞固定或低温保存备用。
    化学处理法获得的细胞存活率低,细胞产量较低,细胞碎片和细胞聚集量不稳定。
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